Filtrasi Aliran Tangensial TFF Dikombinasikan Dengan Ultrasentrifugasi Untuk Persiapan Vesikel Ekstraseluler Kecil Yang Efisien

Vesikel ekstraseluler kecil (sEVs) adalah vesikel berskala nano yang disekresikan oleh sel yang mengandung asam nukleat, protein, molekul kecil, dan komponen lainnya, dan memainkan peran penting dalam komunikasi antar sel. Vesikel ekstraseluler kecil tipe eksosom-memiliki kemiripan yang tinggi dengan sel induknya. Dibandingkan dengan nanopartikel buatan, mereka menunjukkan tingkat pembersihan kekebalan yang lebih rendah dan sitotoksisitas yang lebih rendah, menjadikannya kandidat yang menjanjikan sebagai produk barukendaraan pengiriman obat in vivo. Hampir semua jenis sel dapat mengeluarkan vesikel ini, dan penelitian tentang penerapannya sebagai pembawa obat secara bertahap beralih dari laboratorium ke penerapan klinis. Namun,{0}}produksi skala besar masih menjadi hambatan utama.

 

Metode Terkini untuk Isolasi Vesikel Ekstraseluler

Metode isolasi vesikel ekstraseluler saat ini meliputiultrasentrifugasi, sentrifugasi gradien densitas, kromatografi eksklusi ukuran (SEC), dan presipitasi polietilen glikol (PEG).

Pengendapan PEG menawarkan hasil yang tinggi dan pengoperasian yang sederhana, namun hal ini terkait dengan kontaminasi signifikan oleh protein yang tidak diinginkan. Sentrifugasi gradien densitas dan kromatografi-eksklusi ukuran dapat menghasilkan produk dengan-kemurnian tinggi, namun efisiensinya relatif rendah dan prosesnya memakan waktu-memakan waktu. Ultrasentrifugasi banyak digunakan, namun volume pemrosesannya dibatasi oleh kapasitas sentrifugasi, sehingga sulit untuk ditingkatkan.

 

Penerapan Filtrasi Aliran Tangensial untuk Pemisahan sEV

Filtrasi aliran tangensial (TFF) telah diterapkan pada pemisahan nanopartikel seperti liposom dan vektor lentiviral. Di TFF, umpan mengalir secara tangensial melintasi permukaan membran, yang membantu mengurangi pengotoran membran dan membuat proses lebih mudah untuk ditingkatkan skalanya.

Karena vesikel ekstraseluler kecil umumnya berkisar dari30–200nmdiameternya, akaset membran 0,45 μmdapat dipilih dalam sistem TFF untuk menghilangkan protein dan vesikel yang lebih besar, sedangkan aKaset membran 300 kDadapat digunakan untuk menghilangkan protein berbobot molekul-kecil dan memusatkan vesikel ekstraseluler kecil yang ada dalam media kultur.

 

Karakterisasi Bahan Baku Setelah Pemisahan TFF

Analisis pelacakan nanopartikel (NTA) menunjukkan bahwa diameter partikel sebagian besar terdistribusi dalam kisaran0–250nm.

 

 

Namun, mikroskop elektron transmisi (TEM) menunjukkan sejumlah besar protein yang terkontaminasi, sementara tidak ada vesikel ekstraseluler yang diamati. Hasil ini menunjukkan bahwa langkah pemurnian hilir tambahan diperlukan untuk lebih memurnikan vesikel ekstraseluler.

 

Karakterisasi Konsentrat TFF setelah Ultrafiltrasi 100 kDa

Konsentrat TFF diolah lebih lanjut dengan menggunakan aTabung ultrafiltrasi 100 kDa.

NTA menunjukkan bahwa diameter partikel dalam konsentrat yang diperoleh setelah satu dan dua putaran ultrafiltrasi sebagian besar tetap berada dalam kisaran0–250nm. Namun, melakukan ultrafiltrasi dua kali menghasilkan pengurangan jumlah partikel yang diperoleh secara signifikan.

Analisis TEM menunjukkan bahwa tidak ada struktur-seperti vesikel yang teramati dalam konsentrat ultrafiltrasi satu-kali atau dua-kali, sementara sejumlah besar protein yang mengkontaminasi tetap ada.

Karena itu,Ultrafiltrasi 100 kDa tidak dapat digunakan secara efektif untuk memurnikan media kultur setelah konsentrasi TFF.

 

 

Karakterisasi Konsentrat TFF yang Dimurnikan dengan Ultrasentrifugasi

NTA menunjukkan bahwa diameter partikel produk yang dimurnikan sebagian besar didistribusikan dalam kisaran0–250nm.

Yang penting, TEM dengan jelas mengungkap struktur-seperti vesikel di berbagai bidang pandang. Hasil ini menunjukkan bahwa setelah memekatkan media kultur menggunakan TFF,ultrasentrifugasi selanjutnya dapat digunakan untuk pemisahan lebih lanjut dan pemurnian vesikel ekstraseluler.

 

 

Karakterisasi sEVs yang Diisolasi dari Media Pengkondisian Sel Punca Mesenkim Menggunakan TFF Dikombinasikan dengan Ultrasentrifugasi

NTA menunjukkan bahwa diameter partikel produk yang dimurnikan sebagian besar didistribusikan dalam kisaran0–250nm.

Struktur-seperti vesikel diamati oleh TEM. Analisis Western blot menunjukkan ekspresi positif protein terkait vesikel ekstraselulerCD9, CD63, dan ALIXdalam vesikel ekstraseluler yang telah dimurnikan.

Hasil ini mengkonfirmasi bahwa vesikel ekstraseluler kecil yang dimurnikan mengandung eksosom, menunjukkan bahwa metode ini juga dapat digunakan untukisolasi dan ekstraksi eksosom.

 

 

Kesimpulan: TFF Dikombinasikan dengan Ultrasentrifugasi untuk Persiapan sEV Berkualitas Tinggi

Penelitian menunjukkan hal ituKonsentrasi TFF sajamenghasilkan produk yang mengandung sejumlah besar protein yang mengkontaminasi dan oleh karena itu tidak cukup untuk mendapatkan vesikel ekstraseluler yang memenuhi syarat.

Demikian pula dengan menggunakan aTabung ultrafiltrasi 100 kDa untuk pemurnian sekundertidak secara efektif menghasilkan struktur vesikel utuh.

Dengan menggabungkan konsentrasi TFF dengan pemurnian ultrasentrifugasi berikutnya, keuntungan dari kedua teknik tersebut dapat diintegrasikan untuk diperoleh-produk vesikel ekstraseluler kecil berkualitas tinggi.

Dibandingkan dengan ultrasentrifugasi konvensional saja, proses gabungan ini bisa efektifmengurangi waktu pemrosesan keseluruhan dan meningkatkan efisiensi pemisahan.

Dalam alur kerja ini,TFF memungkinkan pengayaan cepat-sampel bervolume besar, mengatasi keterbatasan ultrasentrifugasi konvensional dalam memproses volume sampel yang besar. Ultrasentrifugasi kemudian melakukan pemurnian mendalam untuk menghilangkan pengotor protein yang terkonsentrasi sekaligus membantu menjaga kemurnian dan integritas vesikel.

Selain itu, prosesnya tidak memerlukan penambahanreagen pengendapan kimia eksogen, membantu melestarikan aktivitas biologis vesikel semaksimal mungkin.

Dari perspektif penerjemahan industri, proses ini mempunyai arti pentingmeningkatkan-potensidan dapat membantu mengatasi tantangan yang terkait dengan{0}}produksi vesikel ekstraseluler dalam skala besarpengiriman obat, pengobatan regeneratif, dan pengembangan produk terkait. Hal ini juga memberikan dasar eksperimental yang kuat untuk pengoptimalan proses selanjutnya dan manufaktur skala-percontohan.

 

Referensi

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, dkk.Penetapan Metode Pemisahan Vesikel Ekstraseluler Kecil dengan Filtrasi Aliran Tangensial Dikombinasikan dengan Ultrasentrifugasi. Jurnal Biologi Tiongkok, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.